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中国科学家首次揭示脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9结构

2019-11-03 10:35

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2018年12月31日,《分子细胞》(Molecular Cell)杂志在线发表了中国科学院生物物理研究所王艳丽课题组在CRISPR-Cas系统研究中取得的最新进展。标题为Phage AcrIIA2 DNA Mimicry: Structural Basis of the CRISPR and Anti-CRISPR Arms Race。该研究工作成功解析了Anti-CRISPR 蛋白AcrIIA2 与Streptococcus pyogenes Cas9 蛋白及single-guide RNA 的三元复合物3.3 埃的晶体结构,并结合体内和体外的功能实验,系统地阐述了噬菌体运用Anti-CRISPR 蛋白防御CRISPR-SpyCas9系统的分子机制。王艳丽课题组一直致力于CRISPR-Cas系统抗病毒作用机理的研究,前期研究揭示了一系列重要的CRISPR-Cas系统的作用机理 (Nature 2014, Cell 2015, Cell Res. 2016, Cell 2017a, Cell 2017b, Mol. Cell 2017, Cell 2018);该工作是王艳丽课题组首次在Anti-CRISPR蛋白防御CRISPR-Cas系统作用机理的研究中取得突破。

2019年10月24日,中国科学院生物物理所王艳丽及马萨诸塞州大学医学院Erik J. Sontheimer共同通讯在Molecular Cell 在线发表题为“Structures of Neisseria meningitidis Cas9 Complexes in Catalytically Poised and Anti-CRISPR-Inhibited States”的研究论文,该研究报道了脑膜炎奈瑟氏球菌的两个Cas9同源物与sgRNA,dsDNA或抗CRISPR蛋白复合物的结构。 在Nme1Cas9的HNH催化状态下,可以看到活性位点保持在目标链的可裂解磷酸二酯键处,提供了活性构象的高分辨率视图。 HNH活性构象激活RuvC域。该研究结构解释了Nme1Cas9和Nme2Cas9如何读取不同的PAM序列以及AcrIIC3如何抑制Nme1Cas9活性。这些结构提供了对Cas9结构域重排,引导靶标参与,切割机制和抗CRISPR抑制的见解,从而有利于优化这些基因组编辑平台。

CRISPR/Cas系统是古菌和细菌抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统。CRISPR-Cas系统划分为两大类,第一大类CRISPR-Cas系统由多亚基组成的效应复合物发挥功能;第二大类是由单个效应蛋白(如Cas9, Cas12a, Cas12b, Cas13等)来发挥功能。其中,Cas9, Cas12a, Cas12b均具有RNA介导的DNA核酸内切酶活性,Cas13a具有RNA介导的RNA核酸酶活性。面对细菌的免疫系统(CRISPR-Cas),噬菌体也相应进化出了自己的防御系统(Anti-CRISPR)。2017年首次发现了Listeria monocytogenes 噬菌体来源的四个Anti-CRISPR蛋白,AcrIIA1, AcrIIA2, AcrIIA3 和AcrIIA4。研究发现AcrIIA2和AcrIIA4蛋白在细胞内能够抑制SpyCas9的基因编辑活性。随后的结构和功能研究表明AcrIIA4通过阻断DNA与SpyCas9的结合来抑制SpyCas9的功能,然而AcrIIA2抑制SpyCas9活性的分子机制一直未能阐述清楚。

另外,2018年11月30日,中科院生物物理所王艳丽及章新政共同通讯在Cell 在线发表题为“Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference ”的研究论文,该论文报告了与crRNA复合的Csm结构以及同源或非同源靶RNA结合的Csm复合物的结构。总之,结构研究为crRNA介导的序列特异性RNA切割,RNA靶标依赖性非特异性DNA切割和cOA生成所需的机制过程提供了重要的见解。

4166.com,在该研究中,研究人员首先通过生化实验发现AcrIIA2只与结合有sgRNA的SpyCas9二元复合物结合,并不与自由状态下的SpyCas9结合,也并不与同时结合有sgRNA和dsDNA的SpyCas9三元复合物结合。为了研究AcrIIA2直接抑制SpyCas9活性的分子机制,研究人员利用X-ray晶体学的方法成功解析了AcrIIA2-SpyCas9-sgRNA的三元复合物晶体结构。结构发现AcrIIA2是由三个α螺旋及一个β折叠组成的紧凑结构,它结合在SpyCas9的一个带正电荷的凹槽区域。该区域由PI、HNH、WED和REC2结构域形成。PI结构域上R1333和R1335是识别dsDNA的PAM序列的关键氨基酸,AcrIIA2通过与R1333和R1335形成稳固的氢键从而阻断SpyCas9对PAM序列的识别,进而阻止SpyCas9对dsDNA的结合。而AcrIIA2的α1螺旋与HNH结构域的相互作用可以锚定HNH结构域,阻止其结合DNA必须发生的构象变化。另外,通过结构比对分析发现AcrIIA2有大量的带负电荷的氨基酸占据着dsDNA中PAM结合的位置,这表明AcrIIA2模拟带负电荷的DNA与SpyCas9结合从而阻止DNA与SpyCas9的结合。有趣的是,竞争性结合实验表明AcrIIA2并不能取代已经与SpyCas9-sgRNA结合的dsDNA,而dsDNA也不能取代已经与SpyCas9-sgRNA结合的AcrIIA2。总之,通过结构和功能实验的证明,AcrIIA2主要通过三个步骤来抑制dsDNA的结合。首先,AcrIIA2可以阻断PAM的识别;其次,AcrIIA2占据了dsDNA的结合位点;最后,AcrIIA2通过限制HNH结构域的构象变化来抑制dsDNA的结合。

Cas9是II型CRISPR-Cas系统蛋白,是一种RNA可编程的DNA核酸内切酶,可通过RuvC和HNH结构域切割靶双链DNA。 CRISPR-Cas9保护细菌免受入侵核酸的侵害,并提供了革命性的RNA指导的基因组编辑平台。 Cas9的活性需要CRISPR RNA,反式激活的crRNA和DNA靶位点中的原间隔子相邻基序序列的指导。可以将crRNA和tracrRNA融合到单向导RNA中。

目前,SpyCas9蛋白作为基因组编辑工具被广泛应用于DNA领域的基因编辑,克服了传统基因编辑技术步骤繁琐、耗时长、效率低等缺点,以其较少的成分、便捷的操作以及较高的效率满足了大多数领域的基因编辑需求,并有着潜在的临床应用价值。但是CRISPR-SpyCas9基因编辑系统也存在着一定的脱靶问题,该研究对Anti-CRISPR 蛋白抑制SpyCas9活性分子机制的阐述为控制或终止SpyCas9活性提供了新的参考和思路。有望将Anti-CRISPR 蛋白开发成新的基因编辑终止工具,实现精准基因编辑。

Nme1-Cas9-sgRNA和Nme1-Cas9-sgRNA-dsDNA复合物的整体结构

王艳丽为论文通讯作者。王艳丽课题组的刘亮为论文第一作者。该研究得到科技部、国家自然科学基金以及中科院战略性先导科技专项的资助,上海同步辐射光源以及日本同步辐射光源SPring-8为该研究提供了重要的技术支持。

已经报道了具有不同结合形式的多个Cas9结构。然而,在可用的DNA结合的,预先切割的Cas9结构中,HNH活性位点与crRNA互补靶链的易分裂磷酸二酯相距较远,这表明HNH结构域在确定的结构之前经历了显著的构象变化切割TS。要了解TS裂解的机制,包括通过酶检测足以进行核酸酶激活的Guide-TS互补性,阐明处于DNA结合状态的Cas9复合物的催化能力至关重要。

文章链接

完全互补的Nme1Cas9 sgRNA dsDNA复合物在催化状态下的结构

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