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上交大在岩藻糖基转移酶定向进化方面的最新研

2019-11-03 10:35

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近日,中国科学院植物所研究员庞永珍小组以类黄酮含量丰富的茶叶和百脉根为研究对象,对类黄酮未知生物合成机理,特别是类黄酮糖基化的分子机制展开研究。揭示了特异的糖基转移酶基因亚家族在类黄酮糖基化中的意义以及在植物生长发育中的功能。相关成果在线发表在《实验植物学杂志》上。

近日,上海交通大学的杨广宇研究团队在Science Advances在线发表论文,报道了在岩藻糖基转移酶定向进化方面的最新研究进展。博士生谭玉萌和张勇助理研究员为本文共同第一作者。

研究人员在基因组水平上,从茶叶和百脉根中分别鉴定了178和188个UGT基因,通过对这些基因进行系统进化、组织表达谱和分子对接分析,从中筛选了30多个UGT主要候选基因。通过体外酶活检测,研究人员最终发现了参与合成茶叶涩味类黄酮糖苷以及百脉根主要成分黄酮醇糖苷的关键UGT基因,并分析比较了这些糖基转移酶的酶动力学参数和体内外功能。

在该研究中,研究团队巧妙的利用了细胞膜表面的半乳糖透酶对底物及糖基化产物通透性的差异,建立了可以利用流式细胞仪在单细胞层面对FucTs进行活性检测的FACS筛选体系,速度达到每小时107个克隆以上,一举打破了这类酶的筛选瓶颈。研究团队证明了这一系统可作为一种通用的筛选工具,用于α——1,3——岩藻糖基转移酶、α——1,2——岩藻糖基转移酶,以及岩藻糖苷酶的转糖苷活性等糖基化反应的定向进化中。

类黄酮化合物是对植物、动物和人类健康都具有益处的一大类植物次生代谢产物,主要以糖基化的形式广泛存在于植物不同部位。类黄酮的糖基化是由UGT基因编码的糖基转移酶所催化的。UGT家族基因在植物进化的过程中不断扩增、分化和特化,形成了具有不同底物特异性和区域特异性的UGT基因家族,进而合成了不同植物中成分和功能多样的类黄酮糖苷。

为验证这一体系的有效性,他们对来源于幽门螺杆菌的α——1,3——岩藻糖基转移酶进行了定向进化,成功获得了目前国际报道催化效率最高的突变体,为岩藻糖苷类产品的生物合成提供了高效的催化剂。重要的是,他们通过解析突变酶M32的晶体结构,揭示了突变体功能改变的催化机制,发现突变体α2 Helix的S45突变成F45后,与周围的芳香族氨基酸残基W33和W34形成了独特的“夹钳”结构,将受体底物牢牢的固定在底物结合口袋内,从而使得酶与底物的亲和力提高;并通过分子动力学模拟发现了α5 Helix铰链区D127N,R128E及H131I的三个氨基酸残基的电荷突变促进域间的相对运动变化,提出了动态铰链弯曲运动引发域间运动模型,为揭示GT——B型糖基转移酶的调控机制及进一步的分子改造提供了线索。

(原载于《中国科学报》 2016-11-30 第4版 综合)

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