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北大开发了偏振光结构光显微技术【4166.com】 便

2019-11-03 10:35

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为了研究蛋白在亚细胞结构中的定位和取向,北京大学工学院席鹏研究员课题组与同事近期联合开发了偏振光结构光显微技术。相关研究成果以“Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy”为题,于10月16日发表在《自然·通讯》期刊。

?SDOM的原理示意图

结构光成像由于其分辨率高、成像速度快等优点,能够高度兼容于活细胞成像,从而受到生物学家的青睐。借鉴SIM成像原理,席鹏等人构建了空间-方位角的高维复合空间,同时提取荧光偶极子的方位角与空间超分辨信息,从而实现了偏振结构光成像。

10月31日,Nature Methods杂志的“研究亮点”栏目报道了由北京大学席鹏课题组及其合作者提出的一种新的基于偏振偶极子方位角的超分辨技术SDOM。这一技术不仅为超分辨提供了一种全新的荧光偶极子的维度、提升了分辨率,能够更清晰地认识其标记的蛋白结构,还为本领域近期的一个热点争论提供了解答。

为了验证这一技术与SIM的广泛兼容特性,研究人员测试了多种商用SIM系统及自主搭建的SIM平台,以及2D-SIM、3D-SIM、TIRF-SIM成像能力,成功提取荧光分子的偶极子方位信息与超分辨结构信息。他们进行了大量的生物学实验来证明其广泛的适用性,如λ-DNA、BAPE细胞和小鼠肾组织中的肌动蛋白丝、肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互作用,以及中GFP染色的U2OS活细胞微管。研究团队对神经元中的膜相关周期骨架进行了研究。pSIM以高的空间分辨率和准确的偏振检测,揭示了肌动蛋白环在MPS中“并排”组装的新模型,推翻了以往教科书上肌动蛋白环“端到端”的结构假设。pSIM具有高的时空分辨率和独特的偶极子方向信息,在未来解决各种生物问题方面具有广阔的应用前景。

北京大学博士生张昊、清华大学博士生陈龙为共同第一作者,北京大学席鹏教授、澳大利亚悉尼技术大学金大勇教授及清华大学清华信息国家实验室张奇伟课题组的高军涛副研究员为共同通讯作者。

pSIM揭示了肌动蛋白环在MPS中“并排”组装的新模型

从“显微”到“显纳”

一般来说,一项创新技术通常采取如下两种途径来造福科研界:1、将相关技术开放获取,其他学者通过搭建类似系统来得到应用;2、将相关技术商业化,其他学者通过采购仪器来得到应用。该工作开辟了推动科研的第三条途径:通过深入挖掘SIM技术及商用仪器的潜在特性,为现有的SIM系统“赋能”,挖掘出了包括其发明人都没有注意到的现有SIM系统内在的偏振探测特性,使现有系统不经任何改动,就可以实现偏振SIM的功能。这使得许多已有SIM系统的生命科学实验室可以直接进行偏振SIM的分析,将极大地推进偏振超分辨成像的研究。

随着显微技术的发展,人们观察事物的尺度已经可以深入到微米,甚至是纳米级别。

席鹏课题组近年来致力于偏振超分辨技术和SIM超分辨技术的开发,如:1、利用偏振特性的荧光偶极子超分辨技术发表在Light: Science and Applications,并得到Nature Methods的高度评价;2、将SDOM应用于金纳米粒子的SERS超分辨成像;3、开发了减帧SIM技术来提升结构光成像的速率2倍以上;4、参与了Hessian-SIM超高速结构光成像技术的开发,并提出滚动SIM技术,可提升SIM成像速度3倍以上。这些科研进展为该工作奠定了坚实基础。

然而,显微技术本身也有天花板。德国物理学家恩斯特·阿贝曾指出:光学显微镜分辨率的极限,大约是可见光波长的一半,最小约为200纳米。

席鹏和清华大学戴琼海院士是这项工作的共同通讯作者,共同第一作者、共同通讯作者张昊博士得到了北京大学博雅博士后计划资助,共同第一作者陈星晔为清华大学自动化系博士生。本文的神经细胞实验与北京大学麦戈文脑科学中心张研教授课题组合作完成,体外肌动蛋白实验由中国科学院动物所李向东教授课题组合作完成,活细胞微管成像由北京大学生命科学学院陈晓伟课题组合作完成。这项工作的SIM超分辨显微成像在北京大学生物显微平台完成,得到了单春燕等老师的帮助。该工作得到国家自然科学基金委、科技部、北京市科委杰出青年科学基金、北京大学临床+X项目和仪器专项的资助。

不仅如此,显微技术本身的发展局限也会影响到其它学科。北京大学工学院教授席鹏告诉《知识分子》,比如,生物学家更乐于追求在微观层面了解生命的奥秘,“分辨率决定了细胞的研究深度”。

关于偏光

据席鹏介绍,显微镜主要分为光学显微镜和电子显微镜两大类。电子显微镜虽然分辨率可以做到很高,但低温、真空等实验环境往往会影响实验对象的生物活性。因此,科学家们一直在不断努力,试图寻找突破光学显微镜分辨极限的方法。

偏振是光作为电磁波的基本物理属性之一。偏振特性在光场调控、显微成像、量子光学、立体显示等领域得到了广泛的应用。在生物学中,通过偏振成像测量荧光团的偶极子方向,可以揭示靶蛋白的取向。超分辨显微技术虽然能够突破光的衍射极限,实现百纳米尺度的高分辨率成像,但是由于无法获知生物分子的取向性,在应用中受到了极大限制。

在寻求突破的过程中,诺奖得主Eric Betzig于1995年在论文中提出了“从不同维度将荧光分子区分开来,从而实现超分辨”的想法论。这一思想与现实中三维空间观察类似。

在进行显微观察时,人们为了确定单点的位置,会从不同维度对一个点进行描述,最简单的方法就是坐标法:在三维空间确定三个坐标轴,然后用三个维度进行描述。而Betzig教授则添加了第四个维度——时间,将空间上重叠的点分离,从而更加细致的描述一个点的位置。随后,Betzig教授提出了单分子定位超分辨技术PALM,这一技术通过在时间维度将分子分开,从而实现了超分辨。

然而,虽然PALM的空间分辨率可达10-20纳米,却由于该技术需要将粒子在时间上拆分,直接造成时间维度的牺牲,因此其成像时间比较长。

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?Betzig提出的超分辨思想:从另一维度对荧光分子进行分离,从而达到超分辨。

偏振:超分辨显微的新“四维”

此次席鹏课题组则在三维坐标的基础上引入了第四个新的维度——荧光偏振。

荧光的偏振特性(Fluorescence Polarization)的发现要早于超分辨概念,1926年就被Jean Baptiste Perrin等人发现。然而在荧光超分辨显微中,对于荧光的其他特性如荧光强度、激发与吸收光谱、荧光寿命等方面,皆存在很好的应用,但人们却对荧光偶极子的方向却甚少关注。

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